先天性无虹膜是表现为虹膜先天性发育不全、虹膜组织部分或全部缺失的眼部异常, 部分患者合并视网膜、视神经、晶状体、房角及角膜等眼部其他结构异常的改变[1]。该病患者基本均双眼患病[2], 眼部病变常随着年龄增长而加重, 对视功能的影响也日趋严重, 严重影响患者视力及生活质量。约13%先天性无虹膜患者伴有Wilms瘤、智力迟钝和泌尿生殖器异常即WAGR综合征等全身疾病, 通常是由于11p13染色体部分缺失造成[3, 4]。目前报道大约2/3的先天性无虹膜病例为家族性发病, 主要呈常染色体显性遗传, 极少数为常染色体隐性遗传, 另外1/3为散发病例[5]。其发病率为1:96 000~1:64 000, 无种族和性别差异[6]。

先天性无虹膜的发病机制尚未明确, 最早发现的与其致病有关的基因为PAX6[7]。自1998年我国的潘志强教授[8]首次报道PAX6与先天性无虹膜相关以来, PAX6基因杂合突变作为大部分先天性无虹膜的分子遗传基础得到认可。Robinson等[9]报道近80%的先天性无虹膜患者与PAX6基因突变有关。PAX6属于PAX基因家族, 定位在11p13染色体, 是由14个外显子组成的高度保守的转录因子, 其编码的蛋白质含422个氨基酸。到目前为止, 人类PAX6等位基因突变超过400个（Human PAX6 Allelic Variant Database, http：//PAX6.hgu.mrc.ac.uk/）, 尚未见到我国少数民族发生PAX6突变的报道。本研究将对一个土家族的先天性无虹膜家系的临床特点进行归纳, 并对其PAX6基因进行检测, 报告如下。

将来自于华西少数民族聚集地区的一个先天性无虹膜家系作为研究对象, 该家系成员均为土家族, 于2017年1月9日就诊于武汉大学人民医院眼科。家系中共有3代4例患者, 男1例（Ⅱ -1：27岁）, 女3例（Ⅰ -2：51岁, Ⅱ -2：30岁, Ⅲ -2：2岁）, 其遗传方式呈常染色体显性遗传。详细询问家族病史并对家系各成员进行民族确认后, 行视力、裂隙灯显微镜、眼压、眼底、电脑验光、眼球运动、双眼视盘黄斑光学相干断层扫描（OCT）及超声生物显微镜（UBM）检查, 行眼前节及眼底照相; 并对家系成员均行相应的全身检查, 请神经内科会诊予以排除Wilms瘤、智力发育迟缓和泌尿生殖器异常的WAGR综合征。家系图谱见图1。

随机选取武汉大学人民医院体检中心的正常人群, 其中汉族50例、土家族50例作为正常对照组, 经专科检查确认正常对照组人群均无眼科疾患。纳入研究的各个家系成员及正常对照人均签署知情同意书, 该研究经武汉大学人民医院伦理委员会批准（伦理批号：2017035）。

1.2.1 DNA提取 采取家系中所有成员的外周静脉血5 ml, 予以二乙胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝, 去上清液, 双蒸水使其完全溶血, 分离出白细胞, 经蛋白酶K消化后, 采用经典的酚氯仿方法吸出外周白细胞基因组DNA。用紫外分光光度仪测定其浓度及纯度后, 置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 测序实验 由中山大学中山眼科中心临床基因检测室进行测序, 采用Sanger测序法进行检测。使用NimbleGen（Roche）的SeqCap EZ Library SR VS试剂盒（瑞士Roche公司）, Illumina Miseq v2试剂盒（300 Cycles PE, 美国Illumina公司）和Illumina PhiX Control v3试剂盒（美国Illumina公司）, 靶向外显子测序目标区域平均测序深度100x, 其目标序列达到20x以上的区域超过95%, 对所有读句进行碱基识别, 用Strand NGS软件的Run local Realignment Recalibrate Base Qualities序列比对。基于人群主要大规模测序数据库如1 000 genome、ExAC和refSNP排除在正常人群中具有较高频率的变异。每个变异依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）发布的《序列变异解读标准和指南》对变异进行分类, 序列变异使用HGVS命名法。对先证者进行检查发现突变位点后, 对家系其他成员进行该位点验证。

1.2.3 多态性分析 对选取的100名正常对照者进行该突变位点的验证检测, 以排除基因多态性的可能性。

Ⅰ -2双眼角膜混浊, 角膜表面布满新生血管, 无虹膜, 晶状体全白混浊, 向颞上方移位, 可见鼻下方晶状体赤道部, 眼球震颤, 不能注视。Ⅱ -1右眼角膜周边新生血管网, 无虹膜, 晶状体全白并脱位于玻璃体腔, 视神经萎缩, 黄斑中心凹未见, 眼球震颤, 不能注视; 左眼球儿时外伤后萎缩。Ⅱ -2双眼鼻侧结膜粗糙, 鼻侧角膜上皮损害, 虹膜部分缺损（右眼较重）, 晶状体皮质轻度混浊, 黄斑中心凹不见, 眼球震颤, 不能注视。Ⅲ -1双眼瞳孔残膜, 余检查均正常。Ⅲ -2双眼鼻下方虹膜缺损（右眼重）, 晶状体皮质轻度混浊, 眼底黄斑中心凹不见, 眼球轻微震颤。 Ⅰ -1、Ⅱ -3均双眼正常。见图2。

在该家系Ⅰ -2、Ⅱ -1、Ⅱ -2、Ⅲ -2中, 均发现PAX6基因的一个杂合（c.357+1G > A）突变（MIM：106210, 位置：Chr11:31823108）, 该变异导致基因编码区域外显子3与内含子3交界处第一个碱基由G变成A, 导致剪切位点的改变。在家系Ⅲ -1、Ⅰ -2、Ⅱ -3中及100名正常对照者中均未发现该突变。见图3。

PAX6基因是眼球发育的主要控制基因, 在发育中的眼球各种组织中, 如视盘、视泡、视网膜、晶状体和角膜中都有表达, 对组织的演化起重要作用[10]。PAX6基因通过选择剪切产生PAX6蛋白和PAX6（5a）蛋白。PAX6（5a）蛋白选择性剪接使PAX6基因参与多个信号通路的调控[11]。而人类眼部是在多种转录因子（Eye-field transcription factors, EFTFs）共同调控作用下发育成视网膜、晶状体、角膜等眼部结构。有研究发现, 在眼睛发育过程中, PAX6于胚胎第8天甚至更早即出现表达, 时间早于任何形态学分化[12]。EFTFs在眼部早期发育中发挥关键作用。PAX6基因的表达与其表现型呈现明显的剂量依赖关系, 若PAX6突变造成肽链合成提前终止, 将导致PAX蛋白单倍剂量不足。如果它们发生可遗传的突变, 就可能会造成各种眼部先天发育异常疾病。目前发现的已知PAX6突变类型有错义突变、无义突变、框内缺失或插入突变、剪切点错误、移码突变和连缀突变[13, 14]。已经发现PAX6基因杂合突变可导致先天性无虹膜、角膜炎、无眼球、黄斑发育不良、白内障、视神经缺损或发育不全、Peters异常及WAGR综合征等眼部病变[2]。

在本研究中, 通过对我国西部的一个少数民族家系进行检测, 发现PAX6基因的一个杂合突变（c.357+1G > A）, 该变异导致基因编码区域外显子3与内含子3交界处第一个碱基由G变成A, 导致剪切位点的改变。该突变的方式是一个热点突变, 在其他地区和民族家系中已有报道[15, 16], 在国内尚未有土家族相关发现的报道。

在该家系中, 3代共4例患者, 他们具有共同的临床特点：先天性虹膜缺损、晶状体混浊、黄斑发育不良、角膜炎及眼球震颤。但个体之间病情轻重表现不一。虹膜缺损程度上, Ⅰ -2、Ⅱ -1较重, Ⅱ -2、Ⅲ -2相对较轻。通过UBM检查证实, I-2合并有下方房角发育不全和晶状体悬韧带断裂及晶状体颞上移位。Ⅲ -2是年龄最小的患者, 先天性虹膜缺损程度最轻, 仅存在鼻下方虹膜缺损。4例患者中, 仅1例获得OCT的模糊图像, 该图像显示无正常黄斑中心凹结构, Ⅱ -1和Ⅲ -2通过检眼镜检查, 也没有见到正常的黄斑中心凹反光, 基本证实该家系的基因突变导致黄斑发育不良, 从而确认了患者自幼视力低下的原因。同时, 本研究还发现该家系患病人群中, 2岁的Ⅲ -2鼻侧结膜面粗糙, 鼻侧角膜上皮损害, Ⅱ -2鼻侧结膜面更加粗糙, 鼻侧角膜新生血管浸润, Ⅰ -2、Ⅱ -1角膜有大量新生血管, 证实该突变与先天性角膜炎相关[17, 18]。

另外, 该家系的Ⅲ -1表现为双眼瞳孔残膜, 而眼部其他结构正常, 双眼视功能正常, 而家系的其他患病成员在表现为虹膜缺损的同时, 合并有晶状体、角膜及眼底的异常, Ⅲ -1与家系其他患病成员眼部表现迥异。瞳孔残膜系胚胎期晶状体血管膜前部不完全消退所致, 在新生婴儿中常可观察到不同程度的瞳孔残膜, 但随年龄增长, 大部分婴儿眼内残膜逐渐退化[19, 20]。该成员经基因验证, 未发现家系中突变位点的改变, 与家系的基因突变无关, 属于胚胎发育期形成的另一类虹膜异常疾病。

总而言之, 在该土家族的家系中, 通过基因的检测发现了11号染色体上PAX6基因的杂合突变, 即c.357+1G > A。证实了先天性无虹膜是常染色体显性遗传性疾病, 在该家系中, PAX6基因是该病的致病基因。该土家族家系的PAX6的突变证实了在我国人群中, 也存在该突变位点。通过对该家系患者的临床特征分析, 丰富了该突变导致的临床表型, 对家系成员的优生优育提供遗传咨询和指导, 并对其临床治疗起一定的指导作用。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 肖紫云：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。邢怡桥：参与选题、设计和修改论文的结果、结论, 根据编辑部的修改意见进行核修

The authors have declared that no competing interests exist.